“向经典看齐”是生态环境研究中心主任朱永官院士发起，由生态环境研究中心青年学术委员会委员解读经典论文的系列活动。本活动旨在鼓励青年科研人员勇于挑战高难度的科学问题，抢占科技制高点，向本领域顶尖的科学家看齐，力争取得原创性、颠覆性成果，传承经典、砥砺前行。
解读人：肖可青 陈水清
作者：Stefan Radajewski, Philip Ineson, Nisha R. Parekh & J. Colin Murrell
文章标题：Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology
文献来源：Nature
被引次数：1068次（Web of Science）；1492次（Google Scholar）
研究背景
微生物是驱动地球元素生物地球化学循环的核心力量，对于揭示生态系统功能和物质转化机制具有重要意义。然而，传统的微生物研究方法高度依赖于纯培养技术，仅能覆盖极少数可培养的微生物类群，难以全面识别复杂环境中活跃的功能微生物。近年来，分子生物学技术与稳定同位素示踪方法的结合，为实现微生物功能与分类身份的非培养关联提供了新途径。稳定同位素探针技术（SIP）通过同位素标记的底物被特定微生物吸收后整合进其DNA，利用密度梯度离心分离出“重”DNA，并结合基因探针或测序手段进行分析，能够在近原位条件下识别参与特定代谢过程的微生物类群。本文旨在探索SIP方法在土壤环境中对甲醇代谢微生物的应用效果，尤其关注其在强酸性土壤中对不同系统发育类群的识别能力，为复杂微生物群落中活跃功能成员的快速识别提供理论依据与技术支持。
研究思路及核心发现
研究思路
本文研究了稳定同位素探针技术（SIP）识别土壤中代谢活跃微生物的有效性，通过设置含12C甲醇的对照和含13C甲醇的微宇宙培养系统，比较稳定同位素标记后不同微生物类群的DNA分布与组成变化。实验以典型甲基营养菌Methylobacterium extorquen进行纯培养试验，并在橡树林土壤中开展同位素添加实验，以模拟天然环境条件下微生物的代谢响应。通过CsCl-溴化乙锭密度梯度离心法分离出重/轻DNA，并对提取的13C-DNA和12C-DNA分别进行PCR扩增和克隆测序，获得代表性细菌类群的16S rRNA与功能基因（mxaF）序列。研究结果显示，13C甲醇处理土壤中有两类系统发育上差异显著的细菌类群（α-变形菌和酸杆菌门）显著富集，表明SIP技术可在不依赖培养的条件下有效识别活跃代谢类群。此外，功能基因mxaF的多样性分析进一步验证了这些类群的甲醇利用能力，说明SIP在复杂环境中进行微生物功能定位具有较高的灵敏度与特异性。
核心发现
1. SIP方法有效分离同位素标记DNA：
图1展示了利用CsCl/溴化乙锭密度梯度离心成功分离13C-DNA与12C-DNA的结果。纯培养实验中，Methylobacterium extorquens在13CH₃OH底物培养下生长形成的DNA浮力密度显著高于在12CH₃OH底物处理的样本，表现出明显的“重”DNA带
2. 酸性土壤中活跃的甲醇代谢微生物群落结构：
图2 从土壤样品13C-DNA中扩增获得的16S rRNA基因序列的系统发育分析结果表明，两类系统发育上显著不同的微生物类群（α-变形菌和酸杆菌门）在甲醇同化中发挥主要作用。这些结果表明，在酸性森林土壤中存在活跃的甲醇代谢类群，尤其是传统上鲜有报道的酸杆菌门微生物首次被直接证实具备同化甲醇的能力
3. 功能基因mxaF分析验证系统发育识别结果：
图3所示的mxaF基因（编码甲醇脱氢酶α亚基）氨基酸序列系统发育树进一步支持了16S rRNA基因分析结果。从土壤13C-DNA中扩增获得的三个新mxaF序列（M13.1–M13.3）均聚类于α-变形菌纲，与UP（图2）的系统发育归属一致，表明这些新型mxaF基因来源于甲醇代谢活跃菌群。这些结果说明，功能基因与系统发育标记基因的联合分析可提高微生物功能识别的准确性，进一步验证了SIP技术在功能微生物识别上的可行性和可靠性
研究领域地位
稳定同位素探针技术已经成为微生物生态学中不可替代的工具。它通过直接追踪同位素进入微生物生物标志物的方式，实现了“功能-分类-生态作用”三者的有机结合。研究推动了该领域迈向高精度、定量的生态学研究新时代。目前在Web of Science 上获得了1068次引用，并被写入美国微生物学经典教科书。
历史进展概述
- 1998年
13C标记生物标记物的应用: 由H. T. S. Boschker提出使用，结合极性脂质衍生脂肪酸（PLFAs）方法用于测量13C标记的甲烷和乙酸在不同微生物群落中的摄入情况 (Boschker et al., 1998)，该文被引507次（Web of Science）。
- 2000年
DNA-SIP技术的发明：由J. Colin Murrell率先提出，将稳定性同位素示踪和分子生物学方法相结合，能够在复杂的环境中分析微米尺度下微生物的生理特性，以此获取参与土壤物质转化的功能微生物信息 (Radajewski et al., 2000)。该文被引1068次（Web of Science）
- 2015年
q-SIP技术的发明：由Theresa A. McHugh等人提出，利用聚合酶链式反应（qPCR）配合DNA-SIP技术可量化具体物种(ASV或MAG)的标记情况，以了解样品中活跃的微生物及其功能 (Hungate Bruce et al., 2015)。该文被引235次（Web of Science）
该领域主要贡献者及其简介
H. T. S. Boschker，现任荷兰代尔夫特理工大学环境生物技术系高级科学家，在无培养条件下微生物功能识别领域做出了重要贡献。他首次发展了结合稳定同位素标记13C与生物标志物PLFAs分析的方法，实现了将特定微生物群体与具体生物地球化学过程直接关联，为研究沉积物中微生物的碳利用与能量流动提供了关键技术支持
Colin Murrell，英国东安格利亚大学教授，欧洲分子生物学会院士，是单碳化合物微生物代谢研究领域的国际权威。2000年发明了稳定性同位素示踪环境微生物的DNA-SIP技术，并被写入美国微生物学经典教科书。2012年创建了地球与生命系统整合研究中心ELSA，研究微生物在应对全球变化、生态服务功能及农业可持续发展等方面的作用。2014年当选为国际微生物生态学会（ISME）副主席，并于2016年担任主席，目前在 ISME执行顾问委员会任职，是微生物学领域的世界顶尖科学家
Theresa A. McHugh，现任美国华盛顿大学健康指标与评估研究所科普作家，是微生物生态学领域的重要学者，在稳定同位素探针（SIP）技术的发展和应用方面作出了突出贡献。她参与提出并发展了定量稳定同位素探针（qSIP）技术，首次实现了微生物类群水平上同位素同化的定量测量。McHugh 的研究广泛涉及微生物碳利用、群落代谢塑性、系统发育多样性与土壤碳循环之间的关系，在土壤微生物功能研究中具有深远影响
参考文献
Boschker, H.T.S., Nold, S.C., Wellsbury, P., Bos, D., de Graaf, W., Pel, R., Parkes, R.J., Cappenberg, T.E., 1998. Direct linking of microbial populations to specific biogeochemical processes by 13C-labelling of biomarkers. Nature 392, 801-805.
Hungate Bruce, A., Mau Rebecca, L., Schwartz, E., Caporaso, J.G., Dijkstra, P., van Gestel, N., Koch Benjamin, J., Liu Cindy, M., McHugh Theresa, A., Marks Jane, C., Morrissey Ember, M., Price Lance, B., 2015. Quantitative Microbial Ecology through Stable Isotope Probing. Applied and Environmental Microbiology 81, 7570-7581.
Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N.R., Murrell, J.C., 2000. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature 403, 646-649.