中国科学院生态环境中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室汪海林研究组在在哺乳动物基因组DNA 6mdA修饰掺入控制机制方面取得新进展，相关研究成果近日在线发表于EMBO Journal 杂志（Aberrant DNA N6-methyladenine incorporation via adenylate kinase1 is suppressed by ADAL deaminase-dependent 2’-deoxynucleotide pool sanitation, doi: 10.15252/embj.2023113684）。
高等哺乳动物DNA N6-甲基腺嘌呤（6mdA）是表观遗传学领域的一个研究热点。前期工作中，汪海林研究团队（Liu, et al. Cell Res. 2021, 31:94-97）与Musheev研究团队（Musheev, et al. Nat. Chem. Biol. 2020, 16:630-634）独立发现哺乳动物基因组中存在DNA聚合酶依赖的以N6-甲基-2’-脱氧腺苷三磷酸（6mdATP）为底物掺入至复制或修复的DNA而形成的掺入型6mdA（i6mdA）。生理上，与具有表观遗传学效应的甲基化DNA 6mdA一样，i6mdA同样会影响碱基配对和双螺旋构象，进而影响DNA复制和转录。Musheev团队认为，细胞内存在丰富的RNA N6-甲基腺嘌呤（m6A）修饰，其降解后产生的大量m6rA核苷及其磷酸化产物可能通过核酸补救合成途径转化掺入至DNA，形成i6mdA。然而，与Musheev团队的研究结果不同，汪海林团队在他们所研究的细胞中检测到的i6mdA源自外源m6rA核苷。因此，他们认为，机体内RNA m6A降解转化形成i6mdA的通路应该受到严格控制，但具体机制目前尚不清楚。
为了探究哺乳动物中DNA 6mdA掺入控制的分子机制，首先，汪海林/李向军团队利用他们已建立的稳定同位素示踪技术结合超灵敏的高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）的分析方法，追踪哺乳动物细胞中RNA N6-甲基腺嘌呤修饰的代谢。同位素示踪技术可以避免6mdA分析过程中原核生物（细菌、支原体等原核生物DNA中含有高丰度的6mdA修饰）污染，而超灵敏的UHPLC-MS/MS可以实现对哺乳动物中痕量6mdA修饰的准确定量。示踪结果显示哺乳动物细胞中大量RNA m6A修饰（>60%）被成功标记，同时胞内也检测到了丰富的标记的RNA m6A降解产物（游离m6rA核苷及其磷酸化产物）。然而胞内却没有出现稳定同位素标记的游离6mdA核苷及其磷酸化产物，且在大多数测试细胞系中也未检测到标记的i6mdA（即源自RNA m6A降解的i6mdA），仅在少数细胞株中检测到稀少的标记的i6mA (NIH3T3和C2C12细胞)。这些结果提示哺乳动物细胞内存在阻断DNA 6mdA错误掺入的2’-脱氧核苷酸库清除机制（2’-deoxynucleotide pool sanitation）。
随后，汪海林/李向军团队发现脱氨酶ADAL（Adenosine deaminase like protein）的缺失会导致细胞内出现游离的6mdA核苷及其磷酸化产物，以及源自胞内RNA m6A降解的DNA i6mdA。此外，对比存在i6mdA的NIH3T3和C2C12细胞与未检测到i6mdA的mES细胞中的Adal基因的表达水平，他们发现Adal的表达与i6mdA的水平呈现负相关。这些结果表明ADAL参与抑制i6mdA的产生。最后，他们通过代谢酶筛选，发现腺苷酸激酶AK1（Adenylate kinase 1）的过表达促进ADAL缺陷细胞中i6mdA水平的升高，而Ak1的敲低则显著抑制i6mdA的产生，说明AK1同样参与调控i6mdA的形成。
值得注意的是，汪海林/李向军团队在小鼠成纤维NIH3T3细胞和小鼠成肌C2C12细胞中检测到的i6mdA丰度（分别为0.42和0.14 6mdA per 106 dC）比这两个细胞系中已报道的i6mdA丰度低约90-1000倍。该结果同样支持哺乳动物细胞中i6mdA产生受到严格控制的结论。
图1 哺乳动物细胞内2’-脱氧核苷酸库清除机制抑制DNA 6mdA产生的机制示意图
综上所述，这项工作揭示了哺乳动物细胞中存在的抑制潜在DNA 6mdA错误掺入的2’-脱氧核苷酸库清除机制。脱氨酶ADAL以及其他调节因子（如焦磷酸酶MTH1）共同构成了该清除机制。而该机制的缺陷（如在NIH3T3细胞中）和腺苷酸激酶AK1表达的上调会促进异常的6mdA掺入（图1）。该研究将有助于理解表观遗传DNA稳态的维持机制。
中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室陈少坤博士为论文的第一作者，汪海林研究员为通讯作者。中国科学院大学化学科学学院李向军教授为共同通讯作者。
论文链接1：https://www.embopress.org/doi/epdf/10.15252/embj.2023113684
论文链接2：https://www.nature.com/articles/s41422-020-0317-6
论文链接3：https://www.nature.com/articles/s41589-020-0504-2
环境化学与生态毒理学国家重点实验室
2023年6月30日