DNA N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine, 6mA）是原核生物和真核生物中一种重要的表观遗传修饰。2020年汪海林研究组（Cell Res, 2021, 31 (1): 94-97）和Christof Niehrs 研究组（Nat Chem Biol, 2020, 16 (6): 630-634）独立地发现哺乳动物基因组中存在非表观遗传相关、错误掺入的DNA 6mA。尽管DNA 6mA是DNA扩增过程中错误掺入的产物，但错误掺入的6mA在疾病中的作用尚未被探索。
近日，中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室汪海林研究组、中国医学科学院基础医学研究所佟伟民研究组和同济大学医学院高正良研究组合作在Cell Discovery杂志发表了题为“Rare and misincorporated DNA N6-methyladenine is a hallmark of cytotoxic stresses for selectively stimulating the stemness and proliferation of glioblastoma cells”的研究论文（Cell Discovery, 2022, 8:39）（https://www.nature.com/articles/s41421-022-00399-x）。首次揭示了DNA 6mA在人脑胶质瘤中的起源、作用及其潜在机制。
为了消除细菌来源DNA 6mA的干扰，汪海林团队开发了一种抗细菌DNA干扰的、超灵敏、精准的UHPLC-MS/MS分析方法，并应用于人胶质母细胞瘤中的DNA 6mA。他们的研究结果表明，人胶质母细胞瘤中DNA 6mA（~0.08 ppm）极其痕量，比文献报道（Cell, 2018, 175（5): 1228-1243）的水平（~1000 ppm）低12,500倍。与正常脑组织相比，人脑胶质瘤中DNA 6mA显著减少（图1）。通过分别在低氧以及常氧环境中培养胶质瘤细胞，研究组还发现低氧可显著降低DNA 6mA的水平。
美国西奈山医学院房刚教授团队与汪海林团队合作（Science, 2022, 375:515-522）（https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.abe7489），以汪海林团队建立的基于LC-MS/MS的DNA 6mA精准分析为参照，发展了单分子测序为基础的6mASCOPE方法。利用先进的6mASCOPE，他们也证明了人胶质母细胞瘤中DNA 6mA水平远低于文献报道水平。
图1. 人脑胶质瘤中DNA 6mA水平显著降低
与Science论文（2022, 375:515-522）仅测定DNA 6mA丰度不同，汪海林团队通过使用两种不同的重稳定同位素标记方法，进一步探索胶质瘤中DNA 6mA的来源。如果观察到重稳定同位素标记的DNA 6mA，则表明可能存在由甲基化转移酶催化形成的表观遗传相关的DNA 6mA。他们采用建立的超灵敏、精准的6mA分析，并未检测到重稳定同位素标记的DNA 6mA。由此证明观察到的6mA与甲基转移酶无关，而是由DNA聚合酶介导的错误掺入产生。
通过体外的H2O2细胞毒性实验显示，胶质瘤细胞毒性应激可以引起RNA N6-甲基腺嘌呤（m6A) 核苷的释放。同位素标记的m6A核苷的掺入实验显示，RNA m6A核苷可以剂量依赖的以DNA 6mA的方式掺入基因组DNA中。这些结果暗示，胶质瘤中错误掺入的DNA 6mA可能是由于细胞应激引起RNA m6A核苷胞外释放，并通过嘌呤补救合成途径掺入的。
通过对6mA水平与胶质母细胞瘤患者总生存率的相关性分析，表明6mA水平与胶质母细胞瘤患者总生存率呈显著负相关；进一步的Kaplan-Meier生存分析显示，高6mA水平患者的中位总生存率（OS Rate）率是低6mA水平患者的1.78倍（图2）；采用Cox比例风险模型进行生存分析显示，无论是同时调整5mC和5hmC的水平还是同时调整MGMT 启动子突变和TERT突变，6mA水平均与患者总生存率显著相关。相比之下，经典的表观遗传修饰5mC和5hmC水平与患者总生存率并无显著相关。由此，证明了痕量的DNA 6mA而非丰度相对高的DNA 5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是胶质母细胞瘤患者预后不良的潜在生物标志物。
图2. 较高的6mA水平与较差的患者生存率相关
为进一步探究细胞应激产生的m6A核苷对胶质瘤细胞的影响，对m6A核苷处理前后的胶质瘤细胞进行细胞增殖及细胞成像分析。结果显示，m6A核苷会抑制胶质瘤细胞增殖，但同时可刺激一部分细胞形成神经球样细胞团，暗示m6A核苷的出现可刺激一部分胶质母细胞瘤的干性形成，并促进其增殖。由于观察到的DNA 6mA是由m6A核苷经嘌呤补救合成途径错误掺入而形成的，人脑胶质瘤中错误掺入的DNA 6mA水平可能反映细胞毒性应激的程度。
这项研究是关于疾病中DNA 6mA的错误掺入及其在疾病中的潜在标志作用的第一份报道。
中国科学院生态环境研究中心博士生吕聪和中国医学科学院牛亚梅博士为论文的共同第一作者。该研究工作得到国家自然科学基金、国家重点研发计划和中国科学院战略性先导科技专项培育项目支持。
环境化学与生态毒理学国家重点实验室
2022年5月6日